Köszönjük, hogy ellátogatott a www.chinacdoe.com oldalra.Az Ön által használt böngészőverzió korlátozott CSS-támogatással rendelkezik.A legjobb élmény érdekében javasoljuk, hogy használjon frissített böngészőt (vagy tiltsa le a kompatibilitási módot az Internet Explorerben).Addig is a folyamatos támogatás érdekében a webhelyet stílusok és JavaScript nélkül jelenítjük meg.
A helyszíni képességekkel rendelkező labor-on-a-chip rendszerek lehetőséget kínálnak a gyors és pontos diagnózisra, és hasznosak olyan korlátozott erőforrások esetén, ahol nem állnak rendelkezésre orvosbiológiai berendezések és képzett szakemberek.Továbbra is komoly kihívást jelent azonban egy olyan helyszíni vizsgálati rendszer létrehozása, amely egyszerre rendelkezik a többfunkciós adagoláshoz, az igény szerinti kibocsátáshoz, a megbízható teljesítményhez és a reagensek hosszú távú tárolásához szükséges összes funkcióval.Itt egy karral működtetett mikroútkapcsoló technológiát írunk le, amely bármilyen irányba képes manipulálni a folyadékokat, precíz és arányos választ ad az alkalmazott légnyomásra, és stabil marad a hirtelen mozgásokkal és rezgésekkel szemben.A technológiára alapozva egy olyan polimeráz láncreakciós rendszer kifejlesztését is ismertetjük, amely a reagens bejuttatását, keverését és reakciófunkcióit egy folyamatban integrálja, és amely 18 beteg összes klinikai orrmintájánál „minta a válaszban” teljesítményt valósítja meg. Influenza és 18 egyéni kontroll, a fluoreszcencia intenzitása jó összhangban van a standard polimeráz láncreakcióval (Pearson-koefficiens > 0,9).A technológiára alapozva ismertetjük egy polimeráz láncreakciós rendszer kifejlesztését is, amely egy folyamatban integrálja a reagensbevezetést, a keverést és a reakciófunkciókat, amely 18 beteg összes klinikai orrmintájánál "minta a válaszban" teljesítményt valósítja meg. influenzával és 18 egyéni kontrollal, a fluoreszcencia intenzitása jó összhangban van a standard polimeráz láncreakcióval (Pearson-koefficiens > 0,9).Основываясь на этой технологии, мы также описываем разработку системы полимеразной цепной реакции цепной реакции, котора ения реагентов, смешивания и реакции в одном процессе, что обеспечивает выполнение «образец-в-ответ-вы образцов из носа от 18 пациентов с Грипп и 18 отдельных контролей, в хорошем соответствии интенсивности флуоресценции со стандертной полимера циенты Пирсона> 0,9).Ezen a technológián alapuló polimeráz láncreakciós rendszer kifejlesztését is ismertetjük, amely egyetlen folyamatban egyesíti az injektálás, a keverés és a reakció funkcióit, lehetővé téve a mintavételezést a 18 influenzás beteg összes klinikai orrmintájából.és 18 egyedi kontroll, jó összhangban a polimeráz láncreakció standard fluoreszcencia intenzitásával (Pearson-koefficiensek > 0,9).Ezen a technológián alapuló polimeráz láncreakciós rendszer kifejlesztését is leírjuk, amely integrálja a reagens befecskendezési, keverési és reakciófunkciókat, hogy elemezze az összes klinikai orrmintát 18 orrbeteg-mintából. Influenza és 18 egyéni kontroll, a fluoreszcencia intenzitása illeszkedik jól standard polimeráz láncreakcióval (Pearson-koefficiens > 0,9).A javasolt platform garantálja az orvosbiológiai elemzések megbízható automatizálását, és így felgyorsíthatja a gondozási ponton vizsgáló eszközök széles skálájának kereskedelmi forgalomba hozatalát.
Az újonnan megjelenő emberi betegségek, mint például a 2020-as COVID-19 világjárvány, amely több millió ember életét követelte, komoly veszélyt jelent a globális egészségre és az emberi civilizációra1.A betegségek korai, gyors és pontos felismerése elengedhetetlen a vírus terjedésének megfékezéséhez és a kezelési eredmények javításához.A központi diagnosztikai ökoszisztéma, amely központosított laboratóriumokon alapul, ahol a vizsgálati mintákat kórházakba vagy diagnosztikai klinikákba küldik, és szakemberek irányítják, jelenleg világszerte közel 5,8 milliárd ember számára korlátozza a hozzáférést, különösen azok számára, akik korlátozott erőforrásokban élnek.ahol hiányoznak a drága orvosbiológiai berendezések és a képzett szakemberek.klinikusok 2. Ezért sürgősen szükség van egy olcsó és felhasználóbarát labor-on-a-chip rendszer kifejlesztésére, amely lehetővé teszi a gondozási vizsgálat (POCT) képességét, amely időben diagnosztikai információkkal látja el a klinikusokat, hogy megalapozott diagnózisi döntéseket hozzanak. .és kezelés 3.
Az Egészségügyi Világszervezet (WHO) irányelvei kimondják, hogy az ideális POCT-nek megfizethetőnek, felhasználóbarátnak (minimális képzéssel könnyen használható), pontosnak (elkerüli a hamis negatívokat vagy hamis pozitívakat), gyorsnak és megbízhatónak (jó ismételhetőségi tulajdonságokat kell biztosítania), és szállítható (hosszú távú tárolásra alkalmas és a végfelhasználók számára könnyen elérhető)4.Ahhoz, hogy megfeleljenek ezeknek a követelményeknek, a POCT-rendszereknek a következő jellemzőkkel kell rendelkezniük: sokoldalú adagolás a kézi beavatkozás csökkentése érdekében, igény szerinti reagens-szállítás a pontos vizsgálati eredmények érdekében, valamint megbízható teljesítmény a környezeti vibrációnak ellenálló.Jelenleg a legszélesebb körben használt POCT eszköz a több réteg porózus nitrocellulóz membránból álló laterális áramlási szalag5,6, amely nagyon kis mennyiségű mintát tol előre, és kapilláris erő hatására reagál az előre rögzített reagensekkel.Bár előnyük az alacsony költség, az egyszerű használat és a gyors eredmények, az áramlási csík alapú POCT eszközök csak biológiai vizsgálatokhoz (pl. glükózteszt7,8 és terhességi teszt9,10) használhatók anélkül, hogy többlépcsős elemzésre lenne szükség.reakciók (pl. több reagens betöltése, keverés, multiplexelés).Ezenkívül a folyadékmozgást szabályozó hajtóerők (azaz a kapilláris erők) nem biztosítanak jó konzisztenciát, különösen a tételek között, ami rossz reprodukálhatóságot11 eredményez, és az oldalirányú áramlási sávokat elsősorban a jó észleléshez12,13 teszi hasznossá.
A kibővült mikro- és nanoléptékű gyártási lehetőségek lehetőséget teremtettek a kvantitatív mérésekre alkalmas mikrofluidikus POCT eszközök fejlesztésére14,15,16,17.A 18, 19 interfész tulajdonságainak és a 20, 21, 22 csatornák geometriájának beállításával szabályozható ezen eszközök kapillárisereje és áramlási sebessége.Megbízhatóságuk azonban – különösen erősen nedves folyadékok esetén – továbbra is elfogadhatatlan a gyártási pontatlanságok, az anyaghibák és a környezeti rezgésekre való érzékenység miatt.Ezenkívül, mivel a folyadék-gáz határfelületen kapilláris áramlás jön létre, nem lehet további áramlást bevezetni, különösen a mikrofluidikus csatorna folyadékkal való feltöltése után.Ezért a bonyolultabb detektáláshoz a mintainjektálás több lépését kell végrehajtani24,25.
A mikrofluidikus eszközök közül jelenleg a centrifugális mikrofluidikus eszközök jelentik az egyik legjobb megoldást a POCT26,27 számára.Meghajtómechanizmusa abból a szempontból előnyös, hogy a hajtóerő a forgási sebesség beállításával szabályozható.Hátránya azonban, hogy a centrifugális erő mindig a készülék külső széle felé irányul, ami megnehezíti a bonyolultabb elemzésekhez szükséges többlépcsős reakciók megvalósítását.Bár a többfunkciós adagoláshoz a centrifugális erőn kívül további hajtóerők (pl. 28, 29 és még sok más 30, 31, 32, 33, 34, 35 kapillárisok) is be vannak vezetve, előre nem látható folyadéktranszfer továbbra is előfordulhat, mert ezek a járulékos erők általában megrendelések. nagyságrendekkel kisebbek, mint a centrifugális erő, így csak kis működési tartományban hatékonyak, vagy igény szerint nem érhetők el folyadékleadással.Vonzó alternatívának bizonyult a pneumatikus manipulációk beépítése a centrifugális mikrofluidikába, mint például a 36., 37., 38. centrifugális kinetikai módszerek, a 39. termopneumatikus módszerek és a 40. aktív pneumatikus módszerek.A kontrafugodinamikus megközelítéssel egy további üreg és csatlakozó mikrocsatornák integrálódnak a készülékbe külső és belső működéshez, bár a szivattyúzási hatékonysága (75% és 90% közötti tartományban) nagymértékben függ a szivattyúzási ciklusok számától és a viszkozitástól. a folyadéktól.A termopneumatikus módszerben a latex membrán és a folyadékátvivő kamra kifejezetten a bemenet lezárására vagy újranyitására szolgál, amikor a bezárt levegő mennyiségét felmelegítik vagy lehűtik.A fűtési/hűtési beállítás azonban lassú válaszproblémákat okoz, és korlátozza annak használatát hőérzékeny vizsgálatokban (pl. polimeráz láncreakció (PCR) amplifikációja).Az aktív pneumatikus megközelítéssel az igény szerinti kioldás és befelé mozgás érhető el a pozitív nyomás és a nagy fordulatszámú motorok által pontosan beállított fordulatszámok egyidejű alkalmazásával.Vannak más sikeres megközelítések is, amelyek csak pneumatikus működtetőket (41, 42 vagy negatív nyomás 43) és normál zárt szelepeket használnak.A pneumatikus kamrában egymás utáni nyomásgyakorlással a folyadék perisztaltikusan szivattyúzódik előre, az alaphelyzetben zárt szelep pedig megakadályozza a folyadék perisztaltika miatti visszaáramlását, így komplex folyadékműveletek valósulnak meg.Jelenleg azonban csak korlátozott számú olyan mikrofluidikai technológia létezik, amely egyetlen POCT-készülékben képes összetett folyadékműveleteket végrehajtani, beleértve a többfunkciós adagolást, igény szerinti kibocsátást, megbízható teljesítményt, hosszú távú tárolást, nagy viszkozitású folyadékok kezelését, és költséghatékony gyártás.Mindezt egyszerre.A többlépcsős funkcionális működés hiánya is lehet az egyik oka annak, hogy a mai napig csak néhány kereskedelmi POCT-termék, mint a Cepheid, Binx, Visby, Cobas Liat és Rhonda került sikeresen a nyílt piacra.
Ebben a cikkben egy pneumatikus mikrofluidikus aktuátort javasolunk, amely zöldgyűrűs mikrokapcsoló technológián (FAST) alapul.A FAST egyszerre ötvözi az összes szükséges tulajdonságot a reagensek széles skálájához a mikroliterektől a milliliterekig.A FAST rugalmas membránokból, karokból és blokkokból áll.Légnyomás alkalmazása nélkül a membránok, karok és blokkok szorosan lezárhatók, és a benne lévő folyadék hosszú ideig tárolható.Ha megfelelő nyomást alkalmazunk és a kar hosszához igazítjuk, a membrán kitágul, és nyitott helyzetbe tolja a kart, lehetővé téve a folyadék áthaladását.Ez lehetővé teszi a folyadékok többfunkciós, kaszkádos, szimultán, szekvenciális vagy szelektív adagolását.
Kifejlesztettünk egy FAST-ot használó PCR rendszert, amely a mintában válaszadási eredményeket generál az influenza A és B vírusok (IAV és IBV) kimutatására.Elértük az alsó kimutatási határt (LOD), 102 kópia/ml-t, multiplex vizsgálatunk IAV-ra és IBV-re mutatott specifitást és lehetővé tette az influenzavírus patotípus meghatározását.A 18 betegből és 18 egészséges egyénből vett orrtampon mintával végzett klinikai vizsgálatok eredményei jó egyezést mutatnak a fluoreszcencia intenzitásában a standard RT-PCR-rel (Pearson-koefficiens > 0,9).A 18 betegből és 18 egészséges egyénből vett orrtampon mintával végzett klinikai vizsgálatok eredményei jó egyezést mutatnak a fluoreszcencia intenzitásában a standard RT-PCR-rel (Pearson-koefficiens > 0,9).Результаты клинических испытаний с использованием образца мазка из носа от 18 пациентов и 18 здолеизыхпоххеских ответствие интенсивности флуоресценции стандартной ОТ-ПЦР (коэффициенты Пирсона > 0,9).A 18 betegből és 18 egészséges egyénből vett orrtampon mintával végzett klinikai vizsgálatok eredményei jó egyezést mutatnak a standard RT-PCR fluoreszcencia intenzitása között (Pearson-koefficiens > 0,9).0,9）…………………………………………………………………………… Результаты клинических испытаний с использованием образцов назальных мазков от 18 пациентов и 18 пациентов и 18 здоциентов соответствие между интенсивностью флуоресценции и стандартной ОТ-ПЦР (коэффициент Пирсона) > 0,9).A 18 betegtől és 18 egészséges egyéntől vett orrtampon mintákkal végzett klinikai vizsgálatok eredményei jó egyezést mutattak a fluoreszcencia intenzitása és a standard RT-PCR között (Pearson-koefficiens > 0,9).A FAST-POCT eszköz becsült anyagköltsége körülbelül 1 USD (1. kiegészítő táblázat), és nagyüzemi gyártási módszerekkel (pl. fröccsöntéssel) tovább csökkenthető.Valójában a FAST-alapú POCT-eszközök rendelkeznek a WHO által előírt összes szükséges funkcióval, és kompatibilisek az olyan új biokémiai vizsgálati módszerekkel, mint a plazma hőciklus44, az amplifikációmentes immunoassays45 és a nanotest funkcionalizációs tesztek46, amelyek a POCT-rendszerek gerincét képezik.lehetőség.
ábrán.Az 1a. ábra a FAST-POCT platform felépítését mutatja, amely négy folyadékkamrából áll: egy előtároló kamrából, egy keverőkamrából, egy reakciókamrából és egy hulladékkamrából.A folyadékáramlás szabályozásának kulcsa a FAST (rugalmas membránokból, karokból és blokkokból álló) kialakítás az előtároló kamrában és a keverőkamrában.Pneumatikusan működtetett módszerként a FAST kialakítás precíz folyadékáramlás szabályozást biztosít, beleértve a zárt/nyitott kapcsolást, a sokoldalú adagolást, az igény szerinti folyadékleadást, a megbízható működést (pl. környezeti rezgésekre való érzéketlenség), valamint a hosszú távú tárolást.A FAST-POCT platform négy rétegből áll: egy hátlapból, egy rugalmas filmrétegből, egy műanyag fóliarétegből és egy fedőrétegből, amint azt az 1b. ábra nagyított nézete mutatja (részletesen az S1 és S2 kiegészítő ábrákon is látható ).Minden csatorna és folyadékszállító kamra (például előtároló és reakciókamra) PLA (politejsav) szubsztrátumba van beágyazva, 0,2 mm-től (legvékonyabb rész) és 5 mm vastagságig.Az elasztikus fólia anyaga egy 300 µm vastag PDMS, amely „vékony vastagságának” és alacsony rugalmassági modulusának (kb. 2,25 MPa47) köszönhetően légnyomás hatására könnyen kitágul.A polietilén filmréteg 100 µm vastagságú polietilén-tereftalátból (PET) készül, hogy megvédje a rugalmas fóliát a légnyomás miatti túlzott deformációtól.A kamráknak megfelelően a hordozóréteg karokkal van összekötve a fedőréteggel (PLA-ból) csuklópántokkal a folyadék áramlásának szabályozására.Az elasztikus fóliát kétoldalas ragasztószalaggal (ARseal 90880) ragasztottuk a hátlapra, és műanyag fóliával fedtük le.Három réteget állítottunk össze egy szubsztrátumon a fedőréteg T-kapcsos kialakításával.A T-bilincs két lába között rés van.Amikor a csipeszt behelyezték a horonyba, a két láb enyhén meghajlott, majd visszatért eredeti állapotába, és szorosan megkötötte a fedelet és a hátlapot, amikor áthaladt a horonyba (S1 kiegészítő ábra).Ezután a négy réteget csatlakozókkal szerelik össze.
A platform vázlatos diagramja, amely szemlélteti a FAST különféle funkcionális rekeszeit és jellemzőit.b A FAST-POCT platform kinagyított diagramja.c Fotó a platformról egy negyed dolláros érme mellett.
A FAST-POCT platform működési mechanizmusa a 2. ábrán látható. A kulcselemek az alaprétegen lévő blokkok és a fedőrétegen lévő csuklópántok, ami interferencia-kialakítást eredményez, ha a négy réteget T-alakban szereljük össze. .Ha nem alkalmazunk levegőnyomást (2a. ábra), az ütköző illesztés a csuklópánt meghajlását és deformálódását okozza, és a karon keresztül tömítőerő hat, hogy a rugalmas fóliát a blokkhoz nyomja, és a tömítőüregben lévő folyadék meghatározásra kerül. lezárt állapotként.Megjegyzendő, hogy ebben az állapotban a kar kifelé van hajlítva, amint azt a 2a. ábra oldalnézete mutatja.Amikor levegőt juttatnak be (2b. ábra), a rugalmas membrán kifelé tágul a fedél felé, és felfelé tolja a kart, így rést nyit a kar és a blokk között, hogy a folyadék a következő kamrába áramoljon, amelyet nyitott állapotként határoznak meg. .A légnyomás felengedése után a kar visszatérhet eredeti helyzetébe, és a csuklópánt rugalmassága miatt feszes marad.A kar mozgásáról készült videókat az S1 kiegészítő film mutatja be.
A. Sematikus diagram és fényképek zárva.Nyomás hiányában a kar a membránt a blokkhoz nyomja, és a folyadék lezáródik.b Jó állapotban.Nyomás alkalmazásakor a membrán kitágul és felfelé tolja a kart, így a csatorna kinyílik és a folyadék áramolhat.c Határozza meg a kritikus nyomás jellemző méretét!A jellemző méretek közé tartozik a kar hossza (L), a csúszka és a csuklópánt távolsága (l), valamint a kar kiemelkedés vastagsága (t).Fs a tömörítési erő a fojtószelep B pontjában. q az egyenletesen elosztott terhelés a karra.A Tx* a csuklós kar által kifejlesztett nyomatékot jelenti.A kritikus nyomás az a nyomás, amely a kar felemeléséhez és a folyadék áramlásához szükséges.d A kritikus nyomás és az elemméret kapcsolatának elméleti és kísérleti eredményei.n = 6 független kísérletet végeztünk, és az adatokat ± standard deviációban adtuk meg.A nyers adatok nyers adatfájlokként jelennek meg.
A nyalábelméleten alapuló analitikus modellt fejlesztettek ki annak a Pc kritikus nyomásnak a függvényében, amelynél a rés nyílik, a geometriai paraméterektől (például L a kar hossza, l a blokk és a csuklópánt, S a kar A folyadékkal való érintkezési terület t a kar kiemelkedésének vastagsága, amint az a 2c. ábrán látható.Amint azt a Kiegészítő megjegyzések és az S3 kiegészítő ábra részletezi, a rés akkor nyílik meg, amikor \({P}_{c}\ge \frac{2{F}_{s}l}{SL}\), ahol Fs a nyomaték \ ({T}_{x}^{\ast}(={F}_{s}l)\) az interferencia illesztéssel járó erők kiküszöbölésére és a csuklópánt elhajlására.A kísérleti válasz és az analitikai modell jó egyezést mutat (2d. ábra), ami azt mutatja, hogy a Pc kritikus nyomás t/l növekedésével és L csökkenésével növekszik, ami könnyen magyarázható a klasszikus gerendamodellel, azaz a forgatónyomaték t /Lifttel növekszik. .Elméleti elemzésünk tehát egyértelműen azt mutatja, hogy a kritikus nyomás hatékonyan szabályozható az L karhossz és a t/l arány beállításával, ami fontos alapot ad a FAST-POCT platform kialakításához.
A FAST-POCT platform többfunkciós adagolást biztosít (a 3a. ábrán látható betéttel és kísérlettel), ami a sikeres POCT legfontosabb jellemzője, ahol a folyadékok bármilyen irányban és sorrendben (kaszkád, szimultán, szekvenciális) vagy szelektív többcsatornás áramlást biztosítanak. adagolás .– adagoló funkció.ábrán.A 3a(i) ábra egy lépcsőzetes adagolási módot mutat be, amelyben két vagy több kamra van kaszkádolva a különböző reagensek elválasztására szolgáló blokkok és a nyitott és zárt állapotok szabályozására szolgáló emelő segítségével.Nyomás alkalmazásakor a folyadék kaszkádszerűen áramlik a felső kamrából az alsó kamrába.Meg kell jegyezni, hogy a kaszkádkamrák megtölthetők nedves vegyszerekkel vagy száraz vegyszerekkel, például liofilizált porokkal.A 3a(i) ábrán látható kísérletben a felső kamrából származó vörös tinta a kék festékporral (réz-szulfát) együtt áramlik a második kamrába, és sötétkék színűvé válik, amikor eléri az alsó kamrát.A szivattyúzott folyadék szabályozási nyomását is mutatja.Hasonlóképpen, ha egy kar két kamrához van csatlakoztatva, az egyidejű befecskendezési mód lesz, amint az az 1. ábrán látható.3a(ii), amelyben a folyadék egyenletesen elosztható két vagy több kamrában nyomás alkalmazásakor.Mivel a kritikus nyomás a kar hosszától függ, a kar hossza beállítható a szekvenciális befecskendezési mintázat eléréséhez, amint az az 1. ábrán látható.3a. iii.Egy hosszú kart (Pc_long kritikus nyomással) csatlakoztattak a B kamrához, és egy rövid kart (kritikus nyomású Pc_short > Pc_long) az A kamrához. Mivel P1 nyomást (Pc_long < P1 < Pc_short) alkalmaztak, csak a folyadék piros színű. áramolhat a B kamrába, és ha a nyomást P2-re növelték (> Pc_short), akkor a kék folyadék az A kamrába áramolhat. Ez a szekvenciális befecskendezési mód a különböző folyadékokra vonatkozik, amelyek egymás után haladnak át a kapcsolódó kamrákba, ami kritikus a sikeres POCT szempontjából eszköz.Egy hosszú kart (Pc_long kritikus nyomással) csatlakoztattak a B kamrához, és egy rövid kart (kritikus nyomású Pc_short > Pc_long) az A kamrához. Mivel P1 nyomást (Pc_long < P1 < Pc_short) alkalmaztak, csak a folyadék piros színű. áramolhat a B kamrába, és ha a nyomást P2-re növelték (> Pc_short), akkor a kék folyadék az A kamrába áramolhat. Ez a szekvenciális befecskendezési mód a különböző folyadékokra vonatkozik, amelyek egymás után haladnak át a kapcsolódó kamrákba, ami kritikus a sikeres POCT szempontjából eszköz.Длинный рычаг (с критическим давлением Pc_long) был соединен с камерой B, а короткий рычаг Pc_long соединен с камерой A. При приложении давления P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) только жидкость, выделенная красным может камеру b, и ка давение ыо уеличено д д д о д о са применяетс к р чичы жидост, поседователно перещщщы в сnk с с снз из из иánk, ичз иачз дз из из иánk. уешной poct.A B kamrához egy hosszú kart (kritikus nyomású Pc_long) csatlakoztattak, és egy rövid kart (kritikus nyomású Pc_short > Pc_long) az A kamrához. P1 nyomás (Pc_long < P1 < Pc_short) alkalmazásakor csak a folyadék lesz kiemelve. piros színnel a B kamrába áramolhat, és amikor a nyomást P2-re növelték (> Pc_short), a kék folyadék az A kamrába áramolhat. Ezt a szekvenciális befecskendezési módot alkalmazzák a különböző folyadékokra, amelyek egymás után kerülnek át a megfelelő kamrába, ami kritikus a sikeres POCT-ért.eszköz. Длинный рычаг (критическое давление Pc_long) соединен с камерой B, а короткий рычаг (критическое давлеское давлесройсейрой Pcод_slongка) A.A hosszú kar (kritikus nyomás Pc_long) a B kamrához, a rövid kar (kritikus nyomás Pc_short > Pc_long) pedig az A kamrához csatlakozik.При приложении давления P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) в камеру B может поступать только красная жидкость, а при увенияччts> в камеру A может поступать синяя жидкость.Ha P1 nyomást (Pc_long < P1 < Pc_short) alkalmazunk, csak vörös folyadék juthat be a B kamrába, és ha a nyomást P2-re növeljük (> Pc_short), akkor kék folyadék juthat az A kamrába. Ez a szekvenciális befecskendezési mód alkalmas a különböző folyadékokat juttatni a megfelelő kamrákba, ami kritikus a POCT készülék sikeres működéséhez.A 3a(iv) ábra szemlélteti a szelektív befecskendezési módot, ahol a főkamrának volt egy rövid (kritikus nyomású Pc_short) és egy hosszú karja (kritikus nyomással Pc_long < Pc_short), amelyek az A kamrához, illetve a B kamrához voltak csatlakoztatva. egy másik légcsatornába, amely a B kamrához van csatlakoztatva. A folyadék A kamrába való átviteléhez először P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) és P2 (P2 > P1) nyomás P1 + P2 > Pc_short mellett egyidejűleg került a készülékre.A 3a(iv) ábra szemlélteti a szelektív befecskendezési módot, ahol a főkamrának volt egy rövid (kritikus nyomású Pc_short) és egy hosszú karja (kritikus nyomással Pc_long < Pc_short), amelyek az A kamrához, illetve a B kamrához voltak csatlakoztatva. egy másik légcsatornába, amely a B kamrához van csatlakoztatva. A folyadék A kamrába való átviteléhez először P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) és P2 (P2 > P1) nyomás P1 + P2 > Pc_short mellett egyidejűleg került a készülékre.ábrán.3. iv ритическим давлением Pc_long < Pc_short), которые дополнительно соединялись с камерой A и камерой B соответственно.A 3a(iv) a szelektív befecskendezési módot mutatja, amelyben a főkamrának volt egy rövid (kritikus nyomással Pc_short) és egy hosszú karja (kritikus nyomással Pc_long < Pc_short), amelyek az A kamrához, illetve a B kamrához voltak csatlakoztatva.к другому воздушному каналу, соединенному с камерой B. Чтобы сначала передать жидкость в камеру A., к устрой вление P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) и P2 (P2 > P1), где P1 + P2 > Pc_short.A B kamrához csatlakoztatott másik légcsatornába. A folyadék A kamrába való első átviteléhez a P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) és a P2 (P2 > P1) nyomásokat egyidejűleg alkalmaztuk a készüléken, ahol P1 + P2 > Pc_short. 3а (iv) покан р режим селективного врыа, кога основная камерner ыйый стержень (с к к к ( зшном канал, подключенному к комнате B.A 3a(iv) ábra a szelektív befecskendezési módot mutatja, amikor a főkamrának van egy rövid szára (kritikus nyomás Pc_short) és egy hosszú szár (kritikus nyomás Pc_long < Pc_short), amelyek rendre az A és B kamrához csatlakoznak, és egy másik légjáraton kívül, csatlakozik a B szobához.Így a P2 megakadályozza a folyadék bejutását a B kamrába;eközben a P1 + P2 össznyomás meghaladta a kritikus nyomást, hogy aktiválja az A kamrához csatlakoztatott rövidebb kart, hogy a folyadék az A kamrába áramoljon. Aztán amikor a B kamrát fel kellett tölteni, már csak a P1-et kell alkalmaznunk (Pc_long < P1 < Pc_short) a főkamrában, hogy aktiválja a hosszú kart, és hagyja, hogy a folyadék a B kamrába áramoljon. T = 3 másodperctől 9 másodpercig egyértelműen megfigyelhető, hogy az A kamrában a folyadék állandó maradt, míg a kamrában nőtt. B, amikor P1 nyomást alkalmaztunk.eközben a P1 + P2 össznyomás meghaladta a kritikus nyomást, hogy aktiválja az A kamrához csatlakoztatott rövidebb kart, hogy a folyadék az A kamrába áramoljon. Aztán amikor a B kamrát fel kellett tölteni, már csak a P1-et kell alkalmaznunk (Pc_long < P1 < Pc_short) a főkamrában, hogy aktiválja a hosszú kart, és hagyja, hogy a folyadék a B kamrába áramoljon. T = 3 másodperctől 9 másodpercig egyértelműen megfigyelhető, hogy az A kamrában a folyadék állandó maradt, míg a kamrában nőtt. B, amikor P1 nyomást alkalmaztunk.Между тем, общее давление P1 + P2 превысило критическое давление, чтобы активировать более короткий, более короткий, рычоный чтобы позволить жидкости течь в камеру A. Затем, когда требуется заполнить камеру B, нам нужно
a Többfunkciós hozzárendelés illusztrációja, azaz (i) lépcsőzetes, (ii) szimultán, (iii) szekvenciális és (iv) szelektív hozzárendelés.A görbék e négy elosztási mód munkafolyamatát és paramétereit ábrázolják.b Hosszú távú tárolási vizsgálatok eredményei ioncserélt vízben és etanolban.n = 5 független kísérletet végeztünk, és az adatok ± sd c.Stabilitási teszt bemutatók, amikor a FAST eszköz és a kapillárisszelep (CV) eszköz (i) statikus és (ii) rezgő állapotban volt.(iii) Hangerő vs. idő a FAST és CV eszközöknél különböző szögfrekvenciákon.d Vizsgálati eredmények igény szerint közzététele (i) FAST eszköz és (ii) CV eszköz esetében.(iii) A térfogat és az idő közötti kapcsolat szakaszos nyomás üzemmódot használó FAST és CV eszközök esetén.Minden skála, 1 cm.A nyers adatok nyers adatfájlokként állnak rendelkezésre.
A reagensek hosszú távú tárolása egy másik fontos jellemzője a sikeres POCT-eszköznek, amely lehetővé teszi, hogy a képzetlen személyzet több reagenst is kezeljen.Míg számos technológia megmutatta a hosszú távú tárolás lehetőségeit (pl. 35 mikroadagolóval, 48 buborékfóliával és 49 pálcás csomaggal), a csomag befogadásához külön fogadórekeszre van szükség, ami növeli a költségeket és a bonyolultságot;továbbá ezek a tárolómechanizmusok nem teszik lehetővé az igény szerinti adagolást, és a reagensek elvesztését eredményezik a csomagolásban lévő maradékok miatt.A hosszú távú tárolási képességet gyorsított élettartam-teszttel ellenőrizték, CNC-vel megmunkált PMMA anyaggal, annak enyhe érdessége és gázpermeációval szembeni ellenállása miatt (S5 kiegészítő ábra).A tesztkészüléket ionmentesített vízzel (ionmentesített víz) és 70%-os etanollal (illékony reagenseket szimulálva) töltöttük 65 °C-on 9 napig.Mind az ionmentesített vizet, mind az etanolt alumíniumfóliával tároltuk, hogy megakadályozzuk a hozzáférést felülről.A valós idejű egyenérték kiszámításához az Arrhenius-egyenletet és az irodalomban közölt penetrációs aktiválási energiát50,51 használtuk.ábrán.A 3b. ábra az átlagos súlycsökkenési eredményeket mutatja 5, 65°C-on 9 napig tárolt minta esetében, ami 0,30%-nak felel meg ionmentesített víz és 0,72%-nak 70%-os etanol esetén 2 év alatt 23°C-on.
ábrán.A 3c. ábra a vibrációs tesztet mutatja.Mivel a kapilláris szelep (CV) a legnépszerűbb folyadékkezelési módszer a meglévő POCT28,29 készülékek között, összehasonlításként egy 300 µm széles és 200 µm mély CV készüléket használtunk.Látható, hogy amikor mindkét eszköz álló helyzetben marad, a FAST-POCT platformon lévő folyadék tömít, a CV készülékben pedig a folyadék a csatorna hirtelen kitágulása miatt leblokkol, ami csökkenti a kapilláris erőket.Azonban ahogy az orbitális vibrátor szögfrekvenciája növekszik, a FAST-POCT platformon lévő folyadék tömített marad, de a CV-eszközben lévő folyadék az alsó kamrába áramlik (lásd még az S3 kiegészítő filmet).Ez arra utal, hogy a FAST-POCT platform deformálható csuklópántjai erős mechanikai erőt tudnak kifejteni a modulra, hogy szorosan lezárják a folyadékot a kamrában.A CV-készülékekben azonban a folyadék a szilárd, a levegő és a folyékony fázis közötti egyensúly miatt megmarad, instabilitást okozva, a rezgések pedig felboríthatják az egyensúlyt és váratlan áramlási viselkedést okozhatnak.A FAST-POCT platform előnye, hogy megbízható funkcionalitást biztosít, és elkerüli a meghibásodásokat a szállítás és az üzemeltetés során általában előforduló rezgések jelenlétében.
A FAST-POCT platform másik fontos jellemzője az igény szerinti kiadás, amely a kvantitatív elemzés kulcsfontosságú követelménye.ábrán.A 3d összehasonlítja a FAST-POCT platform és a CV-eszköz igény szerinti kiadását.ábrából.3d(iii) azt látjuk, hogy a FAST eszköz gyorsan reagál a nyomásjelre.Amikor nyomást gyakoroltunk a FAST-POCT platformra, a folyadék áramlott, a nyomás felengedésekor az áramlás azonnal leállt (3d(i) ábra).Ez a művelet a csuklópánt gyors rugalmas visszatérésével magyarázható, amely visszanyomja a kart a blokkhoz, és ezzel bezárja a kamrát.A folyadék azonban tovább áramlott a CV-eszközben, ami végül körülbelül 100 µl váratlan folyadéktérfogatot eredményezett a nyomás felengedése után (3d (ii) ábra és S4 kiegészítő film).Ez azzal magyarázható, hogy az első injekció után a CV teljes átnedvesedése után megszűnt a kapilláris tapogató hatás.
A különböző nedvesíthetőségű és viszkozitású folyadékok ugyanazon eszközben való kezelése továbbra is kihívást jelent a POCT alkalmazások számára.A rossz nedvesíthetőség szivárgáshoz vagy más váratlan áramlási viselkedéshez vezethet a csatornákban, és gyakran olyan kiegészítő berendezésekre van szükség, mint az örvénykeverők, centrifugák és szűrők a nagyon viszkózus folyadékok előállításához 52 .Teszteltük a kritikus nyomás és a folyadék tulajdonságai közötti összefüggést (a nedvesíthetőség és viszkozitás széles skálájával).Az eredményeket az 1. táblázat és az S5 videó mutatja.Látható, hogy a különböző nedvesíthetőségű és viszkozitású folyadékok lezárhatók a kamrában, és nyomás hatására akár 5500 cP viszkozitású folyadékok is átkerülhetnek a szomszédos kamrába, lehetővé téve a magas minták kimutatását. viszkozitás (azaz köpet, a légúti betegségek diagnosztizálására használt nagyon viszkózus minta).
A fenti többfunkciós adagolókészülékek kombinálásával a FAST alapú POCT készülékek széles választéka fejleszthető.Egy példa az 1. ábrán látható. Az üzem tartalmaz egy előtároló kamrát, egy keverőkamrát, egy reakciókamrát és egy hulladékkamrát.A reagensek az előtároló kamrában hosszabb ideig tárolhatók, majd kiüríthetők a keverőkamrába.Megfelelő nyomás mellett a kevert reagensek szelektíven átvihetők hulladékkamrába vagy reakciókamrába.
Mivel a PCR-detektálás az aranystandard az olyan kórokozók kimutatására, mint a H1N1 és a COVID-19, és több reakciólépést foglal magában, alkalmazásként a FAST-POCT platformot használtuk a PCR kimutatására.ábrán.A 4. ábra a PCR tesztelési folyamatot mutatja a FAST-POCT platform használatával.Először az eluáló reagenst, a mágneses mikrogyöngy reagenst, az A mosóoldatot és a W mosóoldatot pipettáztuk az E, M, W1 és W2 előtároló kamrákba.Az RNS-adszorpció szakaszait az 1. ábra mutatja.A 4a. ábrán láthatók és a következők: (1) P1 nyomás (=0,26 bar) alkalmazásakor a minta az M kamrába kerül, és kiürül a keverőkamrába.(2) A P2 levegőnyomás (= 0,12 bar) a keverőkamra aljához csatlakoztatott A porton keresztül érkezik.Jóllehet számos keverési módszer bizonyította potenciálját a folyadékok POCT platformokon történő keverésében (pl. szerpentinkeverés 53, véletlenszerű keverés 54 és szakaszos keverés 55), keverési hatékonyságuk és hatékonyságuk még mindig nem kielégítő.A buborékos keverési módszert alkalmazza, amelyben levegőt vezetnek be a keverőkamra aljába, hogy buborékokat hozzon létre a folyadékban, ami után az erőteljes örvény másodperceken belül teljes keveredést ér el.Buborékkeverési kísérleteket végeztünk, és az eredményeket az S6 kiegészítő ábrán mutatjuk be.Látható, hogy 0,10 bar nyomás alkalmazásakor a teljes keverés körülbelül 8 másodpercet vesz igénybe.A nyomás 0,20 bar-ra emelésével körülbelül 2 másodperc alatt érhető el a teljes keveredés.A keverési hatékonyság kiszámításának módszereit a Módszerek részben mutatjuk be.(3) Használjon rubídium mágnest a gyöngyök kivonásához, majd helyezze nyomás alá a P3-at (= 0,17 bar) a P porton keresztül, hogy a reagensek a hulladékkamrába kerüljenek.ábrán.A 4b, c ábrák a következőképpen mutatják be a mosási lépéseket a szennyeződések mintából való eltávolítására: (1) Az A mosóoldatot a W1 kamrából a P1 nyomású keverőkamrába engedjük.(2) Ezután végezze el a buborékkeverési folyamatot.(3) Az A mosóoldat a hulladékfolyadék kamrába kerül, és a keverőkamrában lévő mikrogyöngyöket a mágnes kihúzza.A W mosás (4c. ábra) hasonló volt az A mosáshoz (4b. ábra).Megjegyzendő, hogy minden A és W mosási lépést kétszer hajtottak végre.A 4d. ábra az RNS gyöngyökből való eluálásának elúciós lépéseit mutatja;az elúciós és keverési bevezetési lépések megegyeznek a fent leírt RNS-adszorpciós és mosási lépésekkel.Amint az elúciós reagensek P3 és P4 nyomáson (=0,23 bar) átkerülnek a PCR reakciókamrába, elérjük a kritikus nyomást a PCR reakciókamra karjának lezárásához.Hasonlóképpen, a P4 nyomás is segíti a hulladékkamrába vezető járat lezárását.Így az összes elúciós reagenst egyenletesen elosztottuk a négy PCR reakciókamrában, hogy elindítsák a multiplex PCR reakciókat.A fenti eljárást az S6 kiegészítő film mutatja be.
Az RNS adszorpciós lépésében a mintát bevezetjük az M bemeneti nyílásba, és az előzőleg tárolt gyöngyoldattal együtt a keverőkamrába injektáljuk.A szemcsék összekeverése és eltávolítása után a reagensek a hulladékkamrába kerülnek.b és c mosási lépések, különböző előre tárolt mosóreagenseket juttatunk a keverőkamrába, majd a keverés és a gyöngyök eltávolítása után a reagenseket a hulladékfolyadék kamrába juttatjuk.d Elúciós lépés: Az elúciós reagensek bevezetése, keverés és gyöngyextrakció után a reagensek átkerülnek a PCR reakciókamrába.A görbék a különböző szakaszok munkafolyamatát és kapcsolódó paramétereit mutatják.A nyomás az egyes kamrákon keresztül kifejtett nyomás.A térfogat a keverőkamrában lévő folyadék térfogata.Minden skála 1 cm-es.A nyers adatok nyers adatfájlokként állnak rendelkezésre.
PCR-vizsgálati eljárást hajtottak végre, és az S7 kiegészítő ábra hőprofilokat mutat be, beleértve a 20 perces reverz transzkripciós időt és a 60 perces termikus ciklusidőt (95 és 60 °C), az egyik termikus ciklus 90 másodperc volt (S7 kiegészítő film)..A FAST-POCT kevesebb időt vesz igénybe egy hőciklus végrehajtásához (90 másodperc), mint a hagyományos RT-PCR (180 másodperc egy hőciklushoz).Ez a mikro-PCR reakciókamra nagy felület/térfogat arányával és alacsony termikus tehetetlenségével magyarázható.A kamra felülete 96,6 mm2, a kamra térfogata 25 mm3, így a felület/térfogat arány körülbelül 3,86.Amint az az S10 kiegészítő ábrán látható, platformunk PCR tesztterületén egy horony van a hátlapon, ami 200 µm vastagságúvá teszi a PCR kamra alját.A hőmérséklet-szabályozó fűtőfelületére egy hővezető rugalmas betét van rögzítve, amely szoros érintkezést biztosít a tesztdoboz hátuljával.Ez csökkenti a platform hőtehetetlenségét és javítja a fűtési/hűtési hatékonyságot.A termikus ciklus során a platformba ágyazott paraffin megolvad, és a PCR reakciókamrába áramlik, tömítőanyagként működik, megakadályozva a reagens elpárolgását és a környezet szennyeződését (lásd az S8 kiegészítő filmet).
Az összes fent leírt PCR detektálási folyamat teljesen automatizált egy egyedi készítésű FAST-POCT műszerrel, amely programozott nyomásszabályozó egységből, mágneses extrakciós egységből, hőmérséklet-szabályozó egységből, valamint fluoreszcens jelrögzítő és feldolgozó egységből állt.Megjegyzendő, hogy a FAST-POCT platformot használtuk az RNS izolálására, majd az extrahált RNS-mintákat használtuk a PCR-reakciókhoz a FAST-POCT rendszer és az asztali PCR rendszer segítségével összehasonlítás céljából.Az eredmények majdnem megegyeztek az S8 kiegészítő ábrán láthatóval.A kezelő egyszerű feladatot hajt végre: beviszi a mintát az M-kamrába, és behelyezi a platformot a műszerbe.A kvantitatív teszteredmények körülbelül 82 percen belül elérhetők.A FAST-POCT eszközökről részletes információ a kiegészítő ábrán található.C9, C10 és C11.
Az influenza A (IAV), B (IBV), C (ICV) és D (IDV) vírusok által okozott influenza általános globális jelenség.Ezek közül az IAV és az IBV a felelős a legsúlyosabb esetekért és szezonális járványokért, a világ népességének 5-15%-át fertőzik meg, 3-5 millió súlyos esetet okozva, és évente 290-650 ezer halálesetet okozva.Légúti betegségek56,57.Az IAV és IB korai diagnózisa elengedhetetlen a megbetegedések és a kapcsolódó gazdasági terhek csökkentése érdekében.A rendelkezésre álló diagnosztikai technikák közül a reverz transzkriptáz polimeráz láncreakció (RT-PCR) tekinthető a legérzékenyebbnek, specifikusabbnak és legpontosabbnak (>99%)58,59.A rendelkezésre álló diagnosztikai technikák közül a reverz transzkriptáz polimeráz láncreakció (RT-PCR) tekinthető a legérzékenyebbnek, specifikusabbnak és legpontosabbnak (>99%)58,59.Среди доступных диагностических методов полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой ительной, специфичной и точной (> 99%)58,59.A rendelkezésre álló diagnosztikai módszerek közül a reverz transzkriptáz polimeráz láncreakció (RT-PCR) a legérzékenyebb, legspecifikusabb és legpontosabb (> 99%)58,59. Из доступных диагностических методов полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой тельной, специфичной и точной (>99%)58,59.A rendelkezésre álló diagnosztikai módszerek közül a reverz transzkriptáz polimeráz láncreakció (RT-PCR) a legérzékenyebb, legspecifikusabb és legpontosabb (>99%)58,59.A hagyományos RT-PCR módszerek azonban megkövetelik a folyadék ismételt pipettázását, keverését, adagolását és átvitelét, ami korlátozza a szakemberek általi felhasználásukat korlátozott erőforrások mellett.Itt a FAST-POCT platformot használták az IAV és az IBV PCR kimutatására, hogy megkapják az alsó kimutatási határt (LOD).Ezenkívül az IAV-t és az IBV-t multiplexelték, hogy különbséget tegyenek a fajok különböző patotípusai között, ígéretes platformot biztosítva a genetikai elemzéshez és a betegség pontos kezeléséhez.
ábrán.Az 5a. ábra a HAV PCR-teszt eredményeit mutatja, 150 µl tisztított virális RNS-t használva mintaként.ábrán.Az 5a(i) ábra azt mutatja, hogy 106 kópia/ml HAV-koncentrációnál a fluoreszcencia intenzitás (ΔRn) elérheti a 0,830-at, és ha a koncentrációt 102 kópia/ml-re csökkentjük, a ΔRn még mindig elérheti a 0,365-öt, ami ennél magasabbnak felel meg. az üres negatív kontrollcsoport (0,002), körülbelül 100-szor magasabb.A hat független kísérleten alapuló mennyiségi meghatározáshoz lineáris kalibrációs görbét állítottunk elő az IAV logaritmusa és ciklusküszöbe (Ct) között (5a(ii) ábra), R2 = 0,993, 102-106 kópia/ml között.az eredmények jó összhangban vannak a hagyományos RT-PCR módszerekkel.ábrán.Az 5a(iii) ábra a FAST-POCT platform 40 ciklusa utáni teszteredmények fluoreszcens képeit mutatja.Azt találtuk, hogy a FAST-POCT platform akár 102 kópia/ml-nél is képes kimutatni a HAV-t.A hagyományos módszernek azonban nincs Ct értéke 102 kópia/ml, így a LOD körülbelül 103 kópia/ml.Feltételeztük, hogy ez a buborékkeverés nagy hatékonyságának köszönhető.A PCR tesztkísérleteket tisztított IAV RNS-en végeztük, hogy kiértékeljük a különféle keverési módszereket, beleértve a rázásos keverést (ugyanaz a keverési módszert, mint a hagyományos RT-PCR műveletnél), a fiola keverést (ez a módszer, 3 s 0,12 bar nyomáson) és a keverés hiányát, mint kontrollcsoportot. ..Az eredmények az S12 kiegészítő ábrán találhatók.Látható, hogy magasabb RNS-koncentrációnál (106 kópia/mL) a különböző keverési módok Ct-értékei közel megegyeznek a buborékkeveréséval.Amikor az RNS-koncentráció 102 kópia/ml-re esett, a rázott keveréknek és a kontrolloknak nem volt Ct értéke, míg a buborékkeverési módszer továbbra is 36,9 Ct értéket adott, ami a 38-as Ct küszöb alatt volt. Az eredmények domináns keverési jellemzőt mutatnak vezikulák, amit más irodalomban is kimutattak, ami szintén magyarázatot adhat arra, hogy a FAST-POCT platform érzékenysége valamivel magasabb, mint a hagyományos RT-PCR.ábrán.Az 5b. ábra tisztított IBV RNS-minták PCR-analízisének eredményeit mutatja 101-106 kópia/ml-ig.Az eredmények hasonlóak voltak az IAV teszthez, R2 = 0,994 és 102 kópia/ml LOD érték.
az influenza A vírus (IAV) PCR-elemzése 106-101 kópia/ml IAV-koncentrációval, negatív kontrollként TE pufferrel (NC).(i) Valós idejű fluoreszcencia görbe.(ii) Lineáris kalibrációs görbe a logaritmikus IAV RNS-koncentráció és a ciklusküszöb (Ct) között a FAST és a hagyományos vizsgálati módszerek esetében.(iii) IAV FAST-POCT fluoreszcens kép 40 ciklus után.b, Influenza B vírus (IBV) PCR kimutatása (i) valós idejű fluoreszcencia spektrummal.(ii) Lineáris kalibrációs görbe és (iii) FAST-POCT IBV fluoreszcencia kép 40 ciklus után.A FAST-POCT platformot használó IAV és IBV kimutatásának alsó határa (LOD) 102 kópia/ml volt, ami alacsonyabb, mint a hagyományos módszereknél (103 kópia/ml).c Multiplex vizsgálati eredmények IAV és IBV esetén.Pozitív kontrollként GAPDH-t, negatív kontrollként TE puffert használtunk az esetleges szennyeződés és a háttéramplifikáció megelőzésére.Négy különböző mintatípus különböztethető meg: (1) Csak GAPDH-negatív minták („IAV-/IBV-”);(2) IAV-fertőzés („IAV+/IBV-”) IAV-val és GAPDH-val;(3) IBV-fertőzés („IAV-/IBV+”) IBV-vel és GAPDH-val;(4) IAV/IBV fertőzés („IAV+/IBV+”) IAV-val, IBV-vel és GAPDH-val.A pontozott vonal a küszöbvonalat jelöli.n = 6 biológiailag független kísérletet végeztünk, az adatok ± szórásban vannak feltüntetve.A nyers adatok nyers adatfájlokként jelennek meg.
ábrán.Az 5c. ábra az IAV/IBV multiplexelési teszt eredményeit mutatja.Itt víruslizátumot használtunk mintaoldatként a tisztított RNS helyett, és négy IAV, IBV, GAPDH (pozitív kontroll) és TE puffer (negatív kontroll) primert adtunk a FAST-POCT platform négy különböző reakciókamrájához.Pozitív és negatív kontrollokat használunk az esetleges szennyeződések és a háttér fokozódásának elkerülésére.A teszteket négy csoportra osztották: (1) GAPDH-negatív minták („IAV-/IBV-”);(2) IAV-fertőzött („IAV+/IBV-”), szemben az IAV-val és a GAPDH-val;(3) IBV-.fertőzött („IAV-”) -/IBV+”) IBV és GAPDH;(4) IAV/IBV („IAV+/IBV+”) fertőzés IAV-val, IBV-vel és GAPDH-val.ábrán.Az 5c. ábra azt mutatja, hogy negatív minták alkalmazásakor a pozitív kontrollkamra ΔRn fluoreszcencia intenzitása 0,860 volt, és az IAV és IBV ΔRn értéke hasonló volt a negatív kontrolléhoz (0,002).Az IAV+/IBV-, IAV-/IBV+ és IAV+/IBV+ csoportok esetében az IAV/GAPDH, IBV/GAPDH és IAV/IBV/GAPDH kamerák szignifikáns fluoreszcencia intenzitást mutattak, míg a többi kamera még a háttérben is fluoreszcencia intenzitást mutatott. 40-es szint a termikus ciklus után.A fenti tesztek alapján a FAST-POCT platform kiemelkedő specificitást mutatott, és lehetővé tette különböző influenzavírusok egyidejű patotipizálását.
A FAST-POCT klinikai alkalmazhatóságának igazolására 36 klinikai mintát (orrtampon mintát) teszteltünk IB betegektől (n=18) és nem IB kontrolloktól (n=18) (6a. ábra).A betegek adatait a 3. kiegészítő táblázat tartalmazza. Az IB fertőzés állapotát a Zhejiang University First Affiliated Hospital (Hangzhou, Zhejiang) egymástól függetlenül megerősítette, és a vizsgálati protokollt jóváhagyta.Minden betegmintát két kategóriába soroltak.Az egyik feldolgozása FAST-POCT, a másik pedig asztali PCR rendszer (SLAN-96P, Kína) segítségével történt.Mindkét vizsgálat ugyanazt a tisztító- és kimutatási készletet használja.ábrán.A 6b. ábra a FAST-POCT és a hagyományos reverz transzkripciós PCR (RT-PCR) eredményeit mutatja.Összehasonlítottuk a fluoreszcencia intenzitást (FAST-POCT) a -log2(Ct) értékkel, ahol Ct a ciklus küszöbértéke a hagyományos RT-PCR-hez.Jó egyetértés volt a két módszer között.A FAST-POCT és az RT-PCR erős pozitív korrelációt mutatott a 0,90-es Pearson-arány (r) értékével (6b. ábra).Ezt követően értékeltük a FAST-POCT diagnosztikai pontosságát.A pozitív és negatív minták fluoreszcencia intenzitás (FL) eloszlását független analitikai mérőszámként adtuk meg (6c. ábra).Az FL értékek szignifikánsan magasabbak voltak az IB betegekben, mint a kontrollokban (****P = 3,31 × 10-19; kétirányú t-teszt) (6d. ábra).Ezután az IBV vevő működési jellemzőinek (ROC) görbéit ábrázoltuk.Azt találtuk, hogy a diagnosztikai pontosság nagyon jó volt, a görbe alatti terület 1 (6e. ábra).Felhívjuk figyelmét, hogy a 2020-tól kezdődően a COVID-19 miatt Kínában kötelező maszkrendelés miatt nem azonosítottunk IBD-ben szenvedő betegeket, így minden pozitív klinikai minta (azaz orrtampon minta) csak IBV-re készült.
Klinikai vizsgálat tervezése.Összesen 36 mintát, köztük 18 betegmintát és 18 nem influenza kontrollt elemeztek a FAST-POCT platform és a hagyományos RT-PCR segítségével.b Mérje fel a FAST-POCT PCR és a hagyományos RT-PCR közötti analitikai konzisztenciát.Az eredmények pozitív korrelációt mutattak (Pearson r = 0,90).c Fluoreszcencia intenzitás szintjei 18 IB betegnél és 18 kontrollnál.d Az IB betegekben (+) az FL értékek szignifikánsan magasabbak voltak, mint a kontrollcsoportban (-) (****P = 3,31 × 10-19; kétirányú t-teszt; n = 36).Minden négyzetes diagramnál a középső fekete jelölő a mediánt, a doboz alsó és felső vonala pedig a 25. és 75. percentilist jelöli.A whiskerek a minimális és maximális adatpontokra terjednek ki, amelyek nem minősülnek kiugró értéknek.e ROC görbe.A d szaggatott vonal a ROC elemzésből becsült küszöbértéket jelöli.Az IBV AUC értéke 1. A nyers adatok nyers adatfájlokként állnak rendelkezésre.
Ebben a cikkben bemutatjuk a FAST-ot, amely rendelkezik az ideális POCT-hoz szükséges jellemzőkkel.Technológiánk előnyei a következők: (1) Sokoldalú adagolás (kaszkád, szimultán, szekvenciális és szelektív), igény szerinti kioldás (az alkalmazott nyomás gyors és arányos felszabadítása) és megbízható működés (150 fokos vibráció) (2) hosszú távú tárolás (2 év gyorsított tesztelés, fogyás kb. 0,3%);(3) sokféle nedvesíthetőség és viszkozitás (viszkozitás 5500 cP) folyadékokkal való munkavégzés képessége;(4) Gazdaságos (A FAST-POCT PCR készülék becsült anyagköltsége körülbelül 1 USD).A többfunkciós adagolók kombinálásával egy integrált FAST-POCT platformot mutattak be és alkalmaztak az influenza A és B vírusok PCR kimutatására.A FAST-POCT mindössze 82 percet vesz igénybe.A 36 orrtamponmintával végzett klinikai tesztek jó összhangot mutattak a fluoreszcencia intenzitásában a standard RT-PCR-rel (Pearson-koefficiens > 0,9).A 36 orrtamponmintával végzett klinikai tesztek jó összhangot mutattak a fluoreszcencia intenzitásában a standard RT-PCR-rel (Pearson-koefficiens > 0,9).Клинические тесты с 36 образцами мазков из носа показали хорошее соответствие интенсивности (коэффициенты Пирсона > 0,9).A 36 orrtampon mintával végzett klinikai tesztek jó egyezést mutattak a standard RT-PCR fluoreszcencia intenzitásával (Pearson-koefficiensek > 0,9). RT-PCR Клинические испытания 36 образцов мазков из носа показали хорошее совпадение интенсивности фотенсивности флуоресц ЦР (коэффициент Пирсона > 0,9).36 orrtamponminta klinikai vizsgálata azt mutatta, hogy a fluoreszcencia intenzitása jó egyezést mutatott a standard RT-PCR-rel (Pearson-koefficiens > 0,9).Ezzel a munkával párhuzamosan különböző feltörekvő biokémiai módszerek (pl. plazma termikus ciklus, amplifikációmentes immunoassay és nanotest funkcionalizációs vizsgálatok) megmutatták potenciáljukat a POCT-ban.A teljesen integrált és robusztus POCT platform hiánya miatt azonban ezek a módszerek elkerülhetetlenül külön előfeldolgozási eljárásokat igényelnek (pl. RNS izolálás44, inkubáció45 és mosás46), ami tovább egészíti ki a jelenlegi munkát ezekkel a módszerekkel a fejlett POCT-funkciók megvalósításához. a szükséges paramétereket.lekérése-válasz-kimeneti teljesítmény.Ebben a munkában, bár a FAST szelep aktiválásához használt légszivattyú elég kicsi ahhoz, hogy egy asztali műszerbe integrálható legyen (S9, S10 ábra), mégis jelentős energiát fogyaszt és zajt kelt.Elvileg a kisebb formájú pneumatikus szivattyúk helyettesíthetők más eszközökkel, például elektromágneses erő alkalmazásával vagy ujjal történő működtetéssel.A további fejlesztések közé tartozhat például a készletek adaptálása a különböző és specifikus biokémiai vizsgálatokhoz, olyan új kimutatási módszerek alkalmazása, amelyek nem igényelnek fűtési/hűtési rendszereket, így eszköz nélküli POCT platformot biztosítanak a PCR alkalmazásokhoz.Meggyőződésünk, hogy tekintettel arra, hogy a FAST platform lehetőséget ad a folyadékok manipulálására, úgy gondoljuk, hogy a javasolt FAST technológia lehetőséget kínál egy közös platform létrehozására nem csak az orvosbiológiai vizsgálatokhoz, hanem a környezeti megfigyeléshez, az élelmiszerek minőségének vizsgálatához, az anyag- és gyógyszerszintézishez is. ..
Az emberi orrtampon minták gyűjtését és felhasználását a Zhejiang University First Affiliated Hospital etikai bizottsága (IIT20220330B) hagyta jóvá.36 orrtamponmintát vettünk, 16 30 év alatti felnőtt, 7 40 év feletti felnőtt, valamint 19 férfi és 17 nő bevonásával.36 orrtamponmintát vettünk, 16 30 év alatti felnőtt, 7 40 év feletti felnőtt, valamint 19 férfi és 17 nő bevonásával.Было собрано 36 образцов мазков из носа, в которых приняли участие 16 взрослых < 30 лет, 7 взрослых ста, 409 взрослых 17 женщин.16 30 év alatti felnőtttől, 7 40 év feletti felnőtttől, 19 férfitól és 17 nőtől 36 orrtamponmintát vettünk..A demográfiai adatokat a 3. kiegészítő táblázat mutatja be. Minden résztvevőtől tájékozott beleegyezést kaptunk.Valamennyi résztvevőt influenzagyanúsnak tartottak, és önként, ellenszolgáltatás nélkül tesztelték őket.
A FAST alap és fedél politejsavból (PLA) készült, és az Ender 3 Pro 3D nyomtatóval (Shenzhen Transcend 3D Technology Co., Ltd.) nyomtatta.Kétoldalas szalagot az Adhesives Research, Inc.-től vásároltunk. Model 90880. A 100 µm vastag PET fóliát a McMaster-Carr cégtől vásároltuk.Mind a ragasztót, mind a PET-fóliát a Silhouette America, Inc. Silhouette Cameo 2 vágójával vágtuk. Az elasztikus fólia PDMS anyagból készül fröccsöntéssel.Először egy 200 µm vastag PET keretet vágtunk le lézerrendszerrel, és egy 3 mm vastag PMMA lapra ragasztottunk 100 µm-es kétoldalas ragasztószalaggal.Ezután a PDMS prekurzort (Sylgard 184; A rész: B rész = 10:1, Dow Corning) a formába öntöttük, és üvegrudat használtunk a felesleges PDMS eltávolítására.70°C-on 3 órás kikeményítés után a 300 μm vastag PDMS film leválasztható volt a formáról.
A sokoldalú terjesztés, az igény szerinti közzététel és a megbízható teljesítmény érdekében a fényképeket nagy sebességű kamerával (Sony AX700 1000 fps) készítik.A megbízhatósági teszthez használt orbitális rázógépet a SCILOGEX-től (SCI-O180) vásároltuk.A légnyomást légkompresszor állítja elő, a nyomásérték beállítására több digitális precíziós nyomásszabályzót használnak.Az áramlási viselkedés tesztelési folyamata a következő.Előre meghatározott mennyiségű folyadékot fecskendeztünk a vizsgálóeszközbe, és nagy sebességű kamerát használtunk az áramlási viselkedés rögzítésére.Ezután rögzített időpontokban állóképeket készítettünk az áramlási viselkedésről készült videókból, és az Image-Pro Plus szoftverrel kiszámították a fennmaradó területet, amelyet aztán megszoroztak a kamera mélységével a térfogat kiszámításához.Az áramlási viselkedést vizsgáló rendszer részletei az S4 kiegészítő ábrán találhatók.
Fecskendezzen be 50 µl mikrogyöngyöt és 100 µl ionmentesített vizet a fiola keverőkészülékébe.Vegyes teljesítményű fényképek készültek nagy sebességű kamerával 0,1 másodpercenként 0,1 bar, 0,15 bar és 0,2 bar nyomáson.A képfeldolgozó szoftver (Photoshop CS6) segítségével ezekről a képekről a keverési folyamat során pixelinformációkat lehet szerezni.A keverési hatékonyságot pedig a következő 53-as egyenlettel érhetjük el.
ahol M a keverési hatékonyság, N a minta pixeleinek teljes száma, ci és \(\bar{c}\) pedig a normalizált és várható normalizált koncentrációk.A keverési hatékonyság 0 (0%, nem kevert) és 1 (100%, teljesen kevert) között van.Az eredményeket az S6 kiegészítő ábra mutatja.
Valós idejű RT-PCR készlet IAV-hoz és IBV-hez, beleértve IAV- és IBV-RNS-mintákat (kat. sz. RR-0051-02/RR-0052-02, Liferiver, Kína), Tris-EDTA puffert (TE-puffer no. B541019) , Sangon Biotech, Kína), a pozitív kontroll RNS-tisztító készlet (cikkszám: Z-ME-0010, Liferiver, Kína) és a GAPDH Solution (cikkszám: M591101, Sangon Biotech, Kína) kereskedelmi forgalomban kapható.Az RNS-tisztító készlet tartalmaz egy kötőpuffert, A mosást, W mosást, eluenst, mágneses mikrogyöngyöket és akril hordozót.Az IAV és IBV valós idejű RT-PCR készletek IFVA nukleinsav PCR kimutatási keveréket és RT-PCR enzimet tartalmaznak.Adjon hozzá 6 µl AcrylCarrier-t és 20 µl mágneses gyöngyöt 500 µl kötőpufferoldathoz, rázzuk fel alaposan, majd készítsük el a gyöngyoldatot.Adjunk hozzá 21 ml etanolt az A és W mosáshoz, jól rázzuk össze, hogy az A és W mosás oldatát kapjuk.Ezután 18 µl fluoreszcens PCR keveréket IFVA nukleinsavval és 1 µl RT-PCR enzimet adtunk 1 µl TE oldathoz, ráztuk és néhány másodpercig centrifugáltuk, így 20 µl IAV és IBV primert kaptunk.
Kövesse a következő RNS-tisztítási eljárást: (1) RNS-adszorpció.Pipettázzunk 526 µl pelletoldatot egy 1,5 ml-es centrifugacsőbe, és adjunk hozzá 150 µl mintát, majd kézzel rázzuk fel és le a csövet 10-szer.Vigyen át 676 µl keveréket az affinitásoszlopra, és centrifugálja 1,88 x 104 g-vel 60 másodpercig.A későbbi lefolyókat ezután eldobják.(2) A mosás első szakasza.Adjunk 500 µl A mosóoldatot az affinitásoszlophoz, centrifugáljuk 1,88 x 104 g-vel 40 másodpercig, és dobjuk ki az elhasznált oldatot.Ezt a mosási folyamatot kétszer megismételtük.(3) a mosás második szakasza.Adjunk hozzá 500 µl W mosóoldatot az affinitásoszlophoz, centrifugáljuk 1,88 × 104 g-vel 15 másodpercig, és dobjuk ki az elhasznált oldatot.Ezt a mosási folyamatot kétszer megismételtük.(4) Elúció.Adjunk 200 µl eluátumot az affinitásoszlophoz, és centrifugáljuk 1,88 x 104 g-vel 2 percig.(5) RT-PCR: Az eluátumot 20 μl primer oldatba injektáltuk PCR csőben, majd a csövet egy valós idejű PCR tesztkészülékbe (SLAN-96P) helyeztük az RT-PCR folyamat végrehajtásához.A teljes kimutatási folyamat körülbelül 140 percet vesz igénybe (20 perc az RNS-tisztítás és 120 perc a PCR-detektálás).
Előzetesen 526 µl gyöngyoldatot, 1000 µl A mosóoldatot, 1000 µl W mosóoldatot, 200 µl eluátumot és 20 µl primer oldatot adtunk hozzá, és tároltuk az M, W1, W2, E kamrákban és a PCR detektáló kamrában.Platform összeszerelés.Ezután 150 µl mintát pipettáztunk az M kamrába, és a FAST-POCT platformot behelyeztük az S9 kiegészítő ábrán látható vizsgálóműszerbe.Körülbelül 82 perc elteltével a vizsgálati eredmények elérhetőek voltak.
Hacsak másképp nem jelezzük, az összes vizsgálati eredmény átlag ± SD-ként jelenik meg legalább hat ismétlés után, kizárólag a FAST-POCT platform és biológiailag független minták használatával.Az elemzésből semmilyen adatot nem zártak ki.A kísérletek nem véletlenszerűek.A kutatók nem voltak vakok a csoportos feladatokra a kísérlet során.
A tanulmány tervezésével kapcsolatos további információkért tekintse meg a természetkutatási jelentés absztraktot, amely ehhez a cikkhez kapcsolódik.
A tanulmány eredményeit alátámasztó adatok a Kiegészítő információkban találhatók.Ez a cikk az eredeti adatokat tartalmazza.
Chagla, Z. & Madhukar, P. A gazdag országokban alkalmazott COVID-19-robosterek késleltetik az oltások beadását mindenki számára.Chagla, Z. & Madhukar, P. A gazdag országokban alkalmazott COVID-19-robosterek késleltetik az oltások beadását mindenki számára.Chagla, Z. és Madhukar, P. A gazdag országokban alkalmazott COVID-19-robosterek mindenkinél késleltetik a vakcinázást.Chagla, Z. és Madhukar, P. A COVID-19 újraoltás a gazdag országokban mindenkinél késlelteti az oltást.Nemzeti orvoslás.27, 1659–1665 (2021).
Faust, L. et al.SARS-CoV-2 tesztelés alacsony és közepes jövedelmű országokban: elérhetőség és megfizethetőség a magánegészségügyi szektorban.mikrobiális fertőzés.22, 511–514 (2020).
Egészségügyi Világszervezet.A kiválasztott gyógyítható szexuális úton terjedő fertőzések globális előfordulása és előfordulása: áttekintés és becslések.Genf: WHO, WHO/HIV_AIDS/2 https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/66818/WHO_HIV_AIDS_2001.02.pdf (2001).
Fenton, EM et al.Több 2D öntött oldaláramú tesztcsík.ASS alkalmazás.alma Mater.Inter Milan.1, 124–129 (2009).
Schilling, KM et al.Teljesen zárt mikrofluidikus papír alapú elemző készülék.végbélnyílás.Kémiai.84, 1579–1585 (2012).
Lapenter, N. et al.A versenyképes papíralapú immunkromatográfia enzimmódosított elektródákkal párosítva lehetővé teszi a vizelet kotininjának vezeték nélküli monitorozását és elektrokémiai meghatározását.Sensors 21, 1659 (2021).
Zhu, X. et al.Betegség biomarkerek számszerűsítése sokoldalú, nanozimbe integrált laterális folyadékplatform segítségével glükométer segítségével.biológiai érzékelő.Bioelektronika.126, 690–696 (2019).
Boo, S. et al.Terhességi tesztcsík patogén baktériumok kimutatására concanavalin A-humán koriongonadotropin-Cu3(PO4)2 hibrid nanovirágok, mágneses elválasztás és okostelefonos leolvasás segítségével.Mikroszámítógép.Magazin.185, 464 (2018).